口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病中的常见疾病，患病率约为0.51%，在口腔黏膜疾病中居第二位。该病好发于中年人，女性多于男性。皮肤及黏膜可单独或同时发病。因其长期糜烂病损有恶变现象，WHO将其列入癌前状态[1]。口腔扁平苔藓的确切病因不明，可能与精神因素、免疫因素、感染因素、遗传因素等有关。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类依赖金属锌的内肽酶，研究比较多的主要涉及降解细胞外基质，在新生血管形成、细胞运动和管腔形成，以及肿瘤侵袭、转移中起重要作用。除此之外，近年的研究还发现其与炎症反应[2]、创伤修复[3]、免疫反应应答[4]有关。已有学者[5]采用免疫组化方法检测出口腔扁平苔藓中有MMP-2，MMP-3，MMP-9，MT1-MMP和TIMP-2的表达。MMP-28是最近发现的新成员。已有研究表明其在肿瘤细胞、皮肤角质形成细胞中有高表达，但在口腔黏膜组织是否有表达目前为止没有研究。口腔黏膜与皮肤有相似的组织结构，虽然皮肤病损与口腔黏膜病损在临床表现上不同，但其病理表现非常相似。因此推测MMP-28在口腔黏膜中也有相似的表达情况。因此，本文对MMP-28在OLP中的表达进行了检测，并探讨其与临床类型的关联，为治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选择2006年9月至2007年9月于中国医科大学口腔医学院综合急诊科手术切取病理确诊的OLP患者37例。年龄23-65岁，平均年龄36岁。男10例，女27例。另取11例正常黏膜作为对照组（NOM），来自牙冠延长术或拔除埋伏阻生牙时需切除的口腔黏膜。将11例正常口腔黏膜记为A组，另37例患者按照临床诊断分为3组，B组：网状型OLP，13例；C组：斑块型OLP，10例；D组：糜烂型OLP，14例。患者知情同意，术前6个月内均未用过激素治疗。所取新鲜标本一部分浸入10%甲醛固定，常规石蜡包埋；另一部分立即投入液氮中，-70℃条件下保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1免疫组化方法。

　　连续切片，厚度为4μm，每个标本切5张，涂多聚赖氨酸防脱片剂，60℃烤片2小时。一抗为鼠抗人MMP-28多克隆抗体，购于上海群己生物技术有限公司，二抗为羊抗鼠IgG，购于武汉博士德生物工程有限公司，DAB显色试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司。PBS代替一抗作阴性对照。一抗的稀释度为1:300。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。采用双盲法观察结果。以镜下细胞浆内出现棕黄色的颗粒为MMP-28的阳性判断标准。在高倍镜下（×400）随机选择5个视野，用高清晰度图像采集处理系统分析阳性信号的表达和分布，并以积分吸光度（integral optical density，IOD）为参数进行半定量检测。

　　1.2.2 蛋白质免疫印迹

　　将组织迅速加入200μl预冷的裂解液中，干净的剪刀充分剪碎后，超声波细胞粉碎机进一步震碎细胞，置于冰上裂解30min。4℃下11000rpm离心20min；取上清，置于-20℃保存。采用改良Lowry法测定蛋白浓度。取蛋白各20μl，分别经10%SDS、5%PAGE凝胶电泳后，抗原转至硝化纤维素膜。放入5%脱脂奶粉中封闭1h，PBST洗膜3次，每次10min。鼠抗人MMP-28多克隆抗体4℃过夜孵化，一抗的稀释度为1:1000。二抗兔抗鼠IgG37℃下杂交1h，碱性磷酸酶显色，PBST漂洗，密度扫描并拍照。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS14.0统计软件对数据进行处理。其中各组间的差异比较采用单因素方差分析（ANOVA）方法，并进行SNK-q检验进行组间两两比较。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化结果

　　在A组中，MMP-28主要为阴性表达，棘层细胞中偶见弱阳性表达，呈淡黄色；B组中MMP-28在棘层和颗粒层表达较A组增强，主要在胞浆中着色，以中等和弱阳性为主。C组中MMP-28的表达与B组相似。D组细胞的染色以深黄棕色为主，一些细胞的胞质可见棕褐色的颗粒沉积。MMP-28在基底层中的表达逐渐增强，以中等和强阳性为主。经过统计学分析，B、C、D各组与A组相比，差异具有显著性（P＜0.05）；B、C组与D组相比，差异具有显著性（P＜0.05）；B、C组之间无显著性差异（P＞0.05）。（图1，表1）

　　图1 MMP-28蛋白在各组组织中的表达（×400）

　　Fig1 The detection of Pro-MMP-28 in every group by immunohistochemistry

　　表1 免疫组化检测各组组织中MMP-28蛋白的表达

　　Table 1 The detection of Pro-MMP-28 in every group by immunohistochemistry

　　组别           病理学改变         例数（n）            IOD值（MMP-28）

　　A组            正常黏膜              11                  5.02±0.71

　　B组            网状型OLP            13                  34.32±2.26①

　　C组            斑块型OLP            10                  29.21±2.28①②

　　D组            糜烂型OLP            14                 131.90±5.24①③

　　①与A组相比，经单因素方差分析，P＜0.05

　　②与B组相比，经单因素方差分析，P＞0.05

　　③与B、C组相比，经单因素方差分析，P＜0.05

　　此外，我们还比较了不同年龄、性别、病损面积的OLP患者中MMP-28蛋白的表达水平，结果均无统计学意义。（表2）

　　表2 免疫组化检测各组组织中MMP-28蛋白的表达

　　Table 2 The detection of Pro-MMP-28 in every group by immunohistochemistry

　　临床特征例数（n=37）IOD值P值

　　性别

　　男1067.26±4.37>0.05

　　女2771.49±5.53

　　年龄

　　≥402172.28±5.23>0.05

　　＜401664.16±4.31

　　病损面积

　　≥3cm21979.88±6.25>0.05

　　＜3cm21869.62±5.18

　　2.2 Western-blot结果

　　蛋白质免疫印迹结果表明在OLP组织中有分子量为56kDa的MMP-28蛋白的表达。MMP-28蛋白在A组中的表达量为15.31±1.82，在B组中的表达量为51.33±5.67，在C组中的表达量为67.85±4.75，在D组中的表达量为93.02±9.12，经统计学分析，B、C、D各组与A组相比，差异具有显著性（P＜0.05）；B、C组与D组相比，差异具有显著性（P＜0.05）；B、C组之间无显著性差异（P＞0.05）。（图2）

　　①与A组相比，经单因素方差分析，P＜0.05

　　②与B组相比，经单因素方差分析，P＞0.05

　　③与B、C组相比，经单因素方差分析，P＜0.05

　　图2 Western blot检测MMP-28蛋白在各组组织中的表达

　　Fig2 The detection of Pro-MMP-28 in every group by Western-blot

　　3 讨论

　　口腔扁平苔藓的典型病理表现为上皮过度不全角化，基底层液化变性以及固有层有密集的淋巴细胞呈带状浸润。颗粒层明显，棘层肥厚者居多，少数萎缩变薄；上皮钉突呈不规则延长，其下端有时变尖呈锯齿状。基底细胞排列紊乱，基底膜界限模糊不清，基底细胞液化明显者可形成上皮下疱。

　　MMP-28是在2001年首次成功克隆并鉴定。它是第一个从人皮肤角化细胞中克隆出来的，因此又被称为“Epilysin”，即上皮水解素。MMP-28基因全长3.0kb，编码520个氨基酸序列，分子量为56kDa，属于MMP-19亚家族[6]。与其他可溶性MMPs相比，MMP-28包含信号肽、具有PRCGVTD序列的前结构域、具有HEIGHTLGLTH序列的Zn2+催化结构域和血红素样结构域[7]，并且MMP-28具有佛林（furin）激活序列RRKKR，无跨膜序列。大多数MMPs基因含有10个外显子，但MMP-28基因仅含有8个外显子。MMP-28启动子具有特异的结构和功能特异性，即在转录起始位点无TATAbox或CCAAT序列，启动子活性依赖能结合Sp家族转录因子的GT-box序列[8]。

　　目前对MMP-28的研究只限于其生化结构和个别肿瘤组织的表达，而确切的生理作用和特异底物尚属未知，但是它的表达形式提示其可能参与组织内环境稳定和创伤愈合[9]。MMP-28高表达于人基底部皮肤和基底上部的角质细胞中，以及睾丸的精子细胞发育以及神经发育过程中[10]。在心、脑、肾、骨骼肌、胎盘、肺、前列腺、肠、结肠及一些肿瘤细胞系中存在着相同的MMP-28群体。在创伤修复过程中和不同形式的癌症中，也可发现MMP-28的高表达[11]。Saarialho-Kere U 等[12]研究发现MMP-28在溃疡型肉芽肿和大水疱等上皮组织损伤中，都需要MMP-28的诱导表达。而在棘皮症或正常皮肤组织中则无表达。在损伤的皮肤组织中，MMP-28在基底部距离伤口较远的角化细胞中表达非常明显，这与其它MMPs在损伤修复中的形式有所不同。有研究表明发育正常性伤疤在任何条件下均不产生MMP-28，而肥大性伤疤均表达活性MMP-28[6]。由此可见，MMP-28参与基底膜重建。

　　本实验中SABC免疫组织化学和Western-blot方法结果均显示，OLP组织中MMP-28蛋白表达水平显著高于正常口腔黏膜组织，且与临床分型有密切关系。OLP主要的病理学改变为上皮下淋巴细胞带状浸润，浸润的淋巴细胞产生的MMPs可以改变细胞外的基质蛋白和整合素，导致基底膜的破坏和皮下裂隙的形成。OLP糜烂型中MMP-28的表达明显高于其它分型患者，推测其原因可能与糜烂型OLP的组织破坏程度高于其它类型，且炎症反应较重有关。Mazzarella N[13]在对糜烂型口腔扁平苔藓和网状型的对比研究中，发现糜烂型口腔扁平苔藓中MMPmRNA的总体表达水平高于网状型。提示MMP中mRNA的总体表达水平可能与临床不同分型有关，这与本实验的结果相符合。

　　笔者在结果统计中，同样考虑到了各种临床特征（年龄、性别、病损面积等）并进行了数据统计，结果显示MMP-28在各组组织中的表达与其无关。综合本文，MMP-28的表达与OLP的临床分型密切相关，随着病变程度的加重，MMP-28的表达逐渐升高。

　　综上所述，检测OLP中MMP-28蛋白的表达有助于预测OLP的恶性行为，有助于研究MMP-28在OLP发生、发展及恶变中的作用，并有可能成为治疗OLP的新途径。

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　　作者信息：

　　姓名孙妍 张英康媛媛

　　性别女女女

　　学历硕士研究生硕士研究生硕士研究生

　　出生1982年1964年4月24日1982年12月26日

　　职称医师副教授医师

　　籍贯辽宁省铁岭市辽宁省沈阳市辽宁省锦州市

　　工作单位中国医科大学口腔医学院中国医科大学口腔医学院中国医科大学口腔医学院

　　研究方向口腔黏膜病的发病机制口腔黏膜病的发病机制口腔黏膜病的发病机制

　　详细地址辽宁省沈阳市和平区南京北街117号辽宁省沈阳市和平区南京北街117号辽宁省沈阳市和平区南京北街117号

　　联系电话13889123104024-22891586024-22891586